Experimente mit humanen Mastzelllinien konnten mittels quantitativer Massenspektromebie gravierende Unterschiede im Proteinmuster aufzeigen. Die weniger aggressiv wachsende Zelllinie HMC-1.1 (KITVS60G-positiv) exprimiert große Mengen des Adaptorproteins FYB. Dagegen enthalten HMC-1.2 Zellen (aggressiver, Kl1V560G, D816V-positiv) signifikant höhere Mengen der Proteine SHIP1, DOK2, UBASH3B (STS-1), und CASS4 (HEPL). FYB ist als positiver Regulator der T-Zellen Signaltransduktionskaskade bekannt, die biologische Funktion in der Mastozytose/Mastzell-Leukämie (MCL) ist bisher unklar. SHIP1 ist eine Lipidphosphatase mit klar definierter Funktion in der Mastzellbiologie. DOK2 gilt als wichtiges (phosphoryliertes) Adaptorprotein (scaffold protein) in der CML. UBASH3B wurde als Protein mit essentiellen Ubiquitinbindedomänen und stark ausgeprägter Tyrosinphosphataseaktivität beschrieben. Während erstere in der Mitose von Bedeutung ist, wird letztere im T-Zellrezeptor Signalweg benötigt. CASS4 ist ein Mitglied der p130cas Adaptorproteinfamilie (BCAR1/p130cas, NEDD9, EFS und CASS4). Sowohl BCAR1 als auch NEDD9 sind für die Regulation der zellulären Adhäsion (focal adhesions) und Zellpolarität wichtig. Über EFS und CASS4 ist hingegen sehr wenig bekannt; CASS4 ist in CML-Zellen an mehreren Tyrosinen sehr stark phosphoryliert (selektive Inhibition durch lmatinib, Preisinger et al. Leukemia, 2013). Von den Vertretern der p130cas Familie ist CASS4 am stärksten in den HMC-1.2 Zellen exprimiert. Die oben angeführten Ergebnisse der Massenspektrometrie konnten durch Western Blot Analyse verifiziert werden. Die entsprechenden mRNAs zeigen ebenso entsprechende Unterschiede.

O.g. Ergebnisse möchten wir entsprechend den oben angeführten Analysen mit Primärmaterial von Patienten mit Mastzell-Leukämie (MCL) aus der Klinik validieren. Dazu benötigen wir vital steril eingefrorenes Knochenmark von Patienten mit KITD816V-positiver MCL.

Folgende Experimente sind geplant:
A) Aufreinigung CD117-positiver Zellen aus vital steril gefrorenen Knochenmark. Die Zellen werden (analog zu Butterfield et al., Leuk Res, 1988) aufgetaut und in lscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; +/- SCF und IL-3) über Nacht kultiviert. Nach Vitalitätskontrolle am nächsten Tag folgt die Anreicherung der Mastzellen mittels anti-CD1 17 Säulen (Miltenyi) und die Kontrolle eines Aliquots der Zellen mittels FACS (CD117, CD45, CD25). Anschließend wird von einem Teil der Zellen eine mRNA Isolierung vorgenommen und die mRNA Level von relevanten Zielgenen (SHIP1, DOK2, UBASH38/STS-1, PYK2/PTK2B, FYN sowie CASS41HEPL, BCAR1, NEDD9 und EFS) analysiert und ferner der Vergleich zu den Kontrollgenen (GAPDH, SHIP2, L YN) durchgeführt. Die daraus gewonnenen Werte werden mit denen der HMC Zellen in Relation gesetzt.
B) Sollten nach der Anreicherung genügend vitale Mastzellen zur Verfügung stehen (30μg Lysat), würde eine Analyse der entsprechenden Proteine mittels Western Blot (analog HMC-1.1 und 1.2) durchgeführt werden.
Ziel der Untersuchungen in Punkt B ist die Verifizierung der Daten aus Punkt A auf Proteinebene.